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半連續發酵在工業生產中的應用

詳情

菌體濃度是發酵控制的關鍵參數,以下我們通過菌體濃度及菌體形態對發酵罐發酵的影響及控制進行分別闡述。
菌體濃度的影響及控制
菌體濃度的大小,在一定條件下,不僅反映菌體細胞的多少,而且反映菌體細胞生理特性不完全相同的分化階段。
在發酵過程中,菌體濃度的大小與菌體的生長速率密切相關,而生長速率又與微生物的種類、遺傳特性、培養基及環境條件有關。
菌體濃度是單位體積培養液中菌體的含量。無論在科學研究上,還是工業發酵控制上,它都是一個重要的參數。
1. 菌體濃度的影響
主要體現在影響產物產率和發酵液溶氧兩方面。
在適當的比生長速率下,發酵產物的產率與菌體濃度成正比關系。
但菌體濃度過高,會對發酵產生多種不利影響,可能改變菌體的代謝途徑,特別是對培養液中溶氧的影響較明顯。
為獲得最高的生產率,需要采用攝氧速率與傳氧速率相平衡的菌體濃度,最好維持在臨界菌體濃度。
在抗生素生產中,如何確定并維持臨界菌體濃度是提高抗生素生產能力的關鍵。
發酵過程中隨著菌體濃度的增加,培養液的攝氧率按比例增加,但表觀黏度也增加,使氧的傳質速率減少,當攝氧速率大于供氧速率時,發酵液溶氧濃度就會減少,并成為限制性因素。
比如,早期酵母發酵,出現過代謝途徑改變、酵母生長停滯、產生乙醇的現象;抗生素發酵中,也受溶氧限制,使產量變低。
2. 菌體濃度的控制
菌體濃度的大小與菌體生長速率有密切關系,而菌體生長速率與環境條件和自身遺傳因素有關,在這些影響因素中,通過改變培養基濃度及中間補料來控制菌體濃度是發酵過程中主要的措施。
首先確定基礎培養基中有適當的配比,避免產生過濃(或過。┑木w量。適宜培養基是確保適宜菌體量的保證。
然后通過中間補料來控制,如當菌體生長緩慢、菌濃太稀時,則可補加一部分磷酸鹽,促進生長,提高菌濃;
但補加過多,則會使菌體過分生長,超過臨界濃度,對產物合成產生抑制作用。
過程補料通過控制碳源的補料速度來控制菌體生長速度,達到控制適宜菌體量的目標。
3.菌體濃度的檢測
工業發酵罐在發酵過程中菌體濃度的測定方法常用的有直接計數法、活菌計數法(平板菌落計數法,cfu/mL)、濁度法、測定重量法(干重法和濕重法)、測定細胞總氮量或總碳量,以及顏色改變單位法(ccu/mL)等。
這些方法各有特點和適用場景,選擇合適的測定方法對于準確評估菌體濃度至關重要。以下介紹一下濁度法、干重法、濕度法。
濁度法用于澄清發酵液中非絲狀菌的菌體濃度的測定。通常取發酵420~600nm波長范圍內測定光密度(OD)。
吸光度要求控制在0.2~0.8范圍內(不同設備有一定差距),此時吸光值與細胞濃度呈線性關系,對于不在此范圍內發酵液,需稀釋在此范圍內測量。
干重法測定時,取一定體積的發酵液離心或過濾,洗去濾渣上可溶物質后,105℃烘至恒重稱量即得干細胞重。
對于不含不溶性固形物的發酵液重現性好,對含有不溶性固形物或者油質的培養液則難以得到準確結果。
濕重法主要指稱取濕菌體質量。取一定體積發酵液,用自然沉降或離心沉降法測定沉降物的濕體積或濕質量,此法只能作為細胞濃度的粗略估計。
菌絲形態的影響及控制  菌體形態判斷的指標主要包括尺寸指標、數量指標、形狀指標、形態特征指標及質地指標五個方面,這些指標可用于評估和量化微生物菌體的形態特征,對于了解菌體的生理狀態和優化發酵過程具有重要意義。
1. 尺寸指標:
菌絲長度:菌絲由分枝處到頂端的長度。
周長:菌絲或菌絲球的周邊長度,對于形狀不規則的菌體,此指標量化程度為中等。
面積:周長所圍的面積,同樣對于形狀不規則的菌體,量化程度為中等。
直徑:過菌球中心到邊緣兩點間的距離,量化程度為中等。
2. 數量指標:
生物量:單位體積液體培養基中菌絲體干重,量化程度高。
菌球數:一定體積液體培養基中菌球的數量,量化程度低,因為菌球計數較困難,且定義模糊。
菌絲團塊:單位體積液體培養基中菌絲團的數量,量化程度低,計數困難,定義模糊。
3. 形狀指標:
長軸:菌絲球最長直徑,量化程度高。
短軸:與長軸垂直的最大長度,量化程度高。
面積比:菌球中實心部分所占總球面積的比率,量化程度低,需要積分計算,實心部分界定困難。
4. 形態特征指標:
分枝頻率:絲狀體中的分枝數量,量化程度中等,局部統計可行,但總體統計因菌絲纏繞程度高導致測定困難。
觸絲長度:菌球非實心部分菌絲的長度,量化程度低,因觸絲數量多,難以準確計量平均長度。
5. 質地指標:
緊密度:單位體積菌球中菌絲干重,量化程度低,因為菌絲球體積難以準確測定,但可通過透光度進行宏觀定量。
粗糙度:菌絲球及菌團外部的不規則性,量化程度低,界定模糊,無法直接量化。
這些指標有助于對菌體的形態進行細致的描述和量化分析,進而可以用于監測和控制發酵過程中菌體的生長狀態,優化發酵條件以提高生產效率。
如果這些指標都不明顯,那么這個菌的菌體形態指標就基本用于是否染菌判斷。
如青霉素生產,生產菌生長一般分為:Ⅰ. 孢子發芽,Ⅱ. 菌絲增殖,Ⅲ. 菌絲分枝旺盛,出現脂肪顆粒,Ⅳ. 菌絲生長減緩,細胞內出現小氣泡,Ⅴ. 氣泡增大,顆粒消失,產物形成,Ⅵ. 氣泡延伸,菌絲自溶。
菌絲形態能夠影響青霉素的生產。在長期的菌株改良中,青霉素產生菌分化為主要呈絲狀生長和結球生長兩種形態。
前者由于所有菌絲體都能充分和發酵液中的基質及氧接觸,故一般比生產速率高;
后者則由于發酵液黏度顯著降低,使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高,從而促進更多的菌絲生長,發酵罐體積產率甚至高于前者。
在絲狀菌發酵中,控制菌絲形態使其保持適當的分支和長度,并避免結球,是獲得高產的關鍵要素之一;
在球狀菌發酵中,使菌絲球保持適當大小和松緊,并盡量減少游離菌絲的含量,也是充分發揮其生產能力的關鍵因素之一。
青霉素生產中,可通過觀察菌絲形態變化來控制發酵。
按規定時間從發酵罐中取樣,根據“鏡檢”中菌絲形態和代謝變化的指標調節發酵溫度,通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發酵時間,以獲得最多青霉素。
當菌絲中空泡擴大、增多及延伸,并出現自溶細胞,表明菌絲趨向衰老,青霉素分泌逐漸停止,菌絲形態上將要進入自溶期。
在菌體自溶期來臨之前,應該立刻放罐,將發酵液迅速進行提取操作。  綜合運用菌體濃度和形態控制策略,結合實時監測和精確調整,可以在發酵工業中實現高效生產。對發酵過程中菌體濃度和形態的深入理解,為優化生產過程和提高抗生素等發酵產品的產量和質量提供了堅實的基礎。 

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